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    公开号:WO1988008307A1
    申请号:PCT/JP1988/000385
    申请日:1988-04-19
    公开日:1988-11-03
    发明作者:Kaoru Nomura；Kazutaka Ohmura；Yuri Shirakura；Yasunori Nakamura
    申请人:The Calpis Food Industry Co., Ltd.；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 発明の名称 ― 腎成長促進剤及びその製造法
    [0003] 産業上の利用分野
    [0004] 本発明は腎成長促進剤及びその製造法に関するもので ある。
    [0005] 更に詳細には、 本発明は、 腎成長促進活性を有する黄 体化ホルモンイ ソ体を有効成分とする腎成長促進剤と そ の製造法に関するものである。
    [0006] 本発明においては、 黄体化ホルモンイ ソ体に腎成長促 進作用のある こ と を確認したもので、 本発明の腎成長促 進剤を投与すれば、 腎細胞が減少した腎臓ゃ腎機能の低 下 した腎臓を活性化し、 賢細胞の増加、 腎機能の増強を 期待できるものであ り、 医薬界に實献する と ころ大なる ものがある。
    [0007] 従来の技術
    [0008] 従来、 黄体化ホルモン又は黄体化ホルモンィ ソ体に腎 成長促進作用がある こ とは知られていない。
    [0009] 本発明者らは、 先に、 下垂体を摘出 したマ ウスにおい て、 腎重量の減少が顕著である と こ ろから、 下垂体に腎 成長を司る何ら かの因子が存在するのではないかとの発. 想から、 下垂体に存在する腎成長因子を求めて鋭意研究 したと こ ろ、 下垂体から腎成長を促進するホルモ ン様成 z 分を分離し、 これに RGF (又ゅレ ノ トロ ピン）と名づけた のである。 (日本臨牀第 44卷第 1号（昭和 61年 1月号）別 冊 84〜88頁） .
    [0010] 図面の簡単な説明
    [0011] 第 1図は、 実施例 1 において、 腎生長因子粗精製物を 等電点鼋気泳動処理した各蛋白含量を示す図である。
    [0012] 発明が解決しょう と.する問題点
    [0013] しかしながら、 ここに得られた RGFは活性が一定しな い粗精製物で、 種々のアンタゴニステッ ク に働く狭雑物 を含むこ とが明らかとなったのである。
    [0014] 本発明者 ら は、 R G Fを単一物質と して収得するため に更に研究を行い、 先に耝精製物と して得た R GFを等電 点の差異によって分離精製処理じたと ころ、 意外にも有 効成分が単一バン ドになる こ と を見出したのである。
    [0015] ここに単一バン ド成分の分析を行い、 一次構造を決定 したと ころ、 全く意外なこ と には、 黄体化ホルモンのィ ソ体の内の 1種である こ とが判明したのである。
    [0016] 従来黄体化ホルモンは単一でなく複数のイソ体よ り な る糖蛋白質である こ とが知られている。 その現象は微小 構造上の多型性に帰因する' c
    [0017] 羊黄体化ホルモンについては、 構成するサブユニッ ト ctのア ミ ノ酸鎖のア ミ ノ基末端、 及びサブユニッ ト の ア ミ ノ酸鐄のカルボキシル基末端が幾通り かの切靳を受 けている こと が報告されている。 （D . N . WA RD ； Int . J . P ep tide Protein Res.27 , 1986 70 -78) X , 人黄体ィ匕ホノレモ ンが、 カ ラムエ レ ク ト ロ フォーカ シングによ り 7 つの ピ ーク に分かれる こ とも報告されている。 （矢野ま り子 ； 日本産科婦人科学会誌 Vol.37， Να 5 703〜 712 ( 1985 ) )。
    [0018] 勿論、 従来は、 黄体化ホルモン及び黄体化ホルモンの 各イ ソ体に腎成長促進作用のある こ とは全く知られてい な かっ たのである。
    [0019] 更に研究を進め、 本発明においては、 黄体化ホルモン イ ソ体がサブュニッ ト ct 3とサブュニッ ト （3 3が結合 した ものである場合に最も強い腎成長促進活性を有する こ と も明らかと したのである。
    [0020] 本発明は、 これら知見から完成されたものである。 本発明は、 黄体化ホルモンイ ソ体を有効成分とする腎成 長促進剤に関するものである。 そ して、 黄体化ホルモ ン イ ソ体がサブユニ ッ ト α 3とサブユニッ ト |3 3 と結合し たものである こ と が好ま しい。
    [0021] また、 本発明は、 腎成長因子粗精製物を等鼋点の差異 によっ て分離精製処理する こ と を特徴とする腎成長促進 活性を有する黄体化ホルモ ンイ ソ体の製造法である。
    [0022] こ こでいぅ等電点の差異によって分離精製する処理と は、 蛋白質等の両性電解質を、 個有の等電点に従って相 互分離し、 分取する処理の こ と をいう 。 たとえばク ロマ ト フ オーカ シ ングゃエ レ ク ト ロ フォ一カ シング等が用い られる。 本発明において、 原料となる腎成長因子 a精製物は、 マウス、 ヒッジ、 ブタ など哺乳動物の尿、 血液あるいは 臓器よ り得られる耝黄体化ホルモン抽出物が使用される あるいは、 遺伝子操作技術を利用 して人工的に製造せし めた培養系よ り得られる粗精製物が用いられる。 あるい は合成化学反応系よ り得られる物にも適用できる.。 いず れに しろ腎成長作用のあるイ ソ体と作用のないイソ体の 混合物を原料とするものである。
    [0023] たとえば、 臓器よ り得る場合には下垂体に硫安水溶液 を加えて、 ホモゲナイズし、 遠心分離し、 上清液を精製 し、 .凍結乾燥し、 凍結乾燥物を溶解して、 S Pセ フ アデッ ク スク ロマ ト、 セフ アデッ ク ス G 1 00ク ロマ ト、 C Mセル口 —スク ロマ 卜、 C0 n . Aク ロマ 卜、 セ フ アデッ ク ス G 100ク ロマ ト等の精製処理を重ねて腎成長因子（R GF )粗精製物 が得られる。
    [0024] ' 得られた腎成長因子（RG F ) 粗精製物は等電点の差異に よって分離精製する処¾を行う こと によっ て、 腎成長促 進活性を有する物質を単一バン ドと して収得する こ とが できる-。
    [0025] こ こ に得られた単一バン ドの腎成長促進活性を有する 物質は、 構成成分である と |5 のサブュニ ッ 卜に分離す る こ と ができ る。 勿論各々のサブュニッ 卜へと分離する こ とで腎成長促進活性は失なおれて し まう 。
    [0026] 分離を行なう方法と して とえば逆相系液体ク ロマ ト グラ フィ 一がある。 分離パタ ーンは、 ア ミ ノ酸の長さ に 応 じて α， ί9 サブユニ ッ ト共にそれぞれ複数の ピーク を 得る こ と ができ る 。 これ等の ピーク は、 既に報告されて い る ， |3 サブュニ ッ 卜のア ミ ノ酸が幾通 り かに切断さ れて短く なつ ているものに相当する こ と が確認さ れた。
    [0027] サブュニ ッ ト α 3 とサブュニ ッ ト j33の結合体は、 黄体 化ホルモ ン活性をわずかに残している が、 著じ る し い腎 成長促進活性を有する点で他の黄体化ホルモ ンイ ソ体と 異なるものである。
    [0028] サブュ ±1 ジ ト α 3， |33 と は、 最も切断を受ていないも の を い う 。 サブユニ ッ ト を再結合 した場合、 最も強い腎 成長促進活性は、 各種の組合わせの中で ct 3， j33の組 合わせに見い出された。
    [0029] 次に本発明の実施例を示す。
    [0030] 実施例 1
    [0031] 豚脳下垂体約 350 g と 0.15M硫安水溶液 1 に フ エ ニル メ チルスル フ ォ二ル フノレオ ライ ド 1 OmM加えたのち、 冷却 しながら ワー リ ング · ブレ.ンダ一にて 2 分間ホモゲナイ ズ した。 PHを 4.0に調節 したのち、 冷却下に充分放置し たのち遠心分離を行い、 上澄液を集め、 更に、 0.5Mメ タ リ ン酸水溶液にて PHを 3.0に調節 したのち遠心分離を行 い、 上澄液を集めた。 上澄液の PHを 6.5〜7.0に調節 した のち、 0.5飽和になる まで硫安を添加 し、 再び冷却下に 充分放置 した。 遠心分離を行い、 沈^を集め、 50〜： LOOra βの 0.2Mリ ン酸ニ力 リ ゥム溶液に懸濁させた。 透析チュ ーブへ移し、 冷却下で充分透祈を行っ たのち、 内容液を 採り出し、 ΡΗを再度 8.5に調節し、 凍結乾燥した。
    [0032] 得 ら れた凍結乾燥粉末を、 0.01Mリ ン酸ニナト リ ゥ ム溶液で溶解したのち、 同緩衝液で平衝化した SP-Sepha dex (Pharmacia)カラムに力、 、 0 · 1Mリ ン酸ニナ 卜 リ ウ厶 溶出画分を集めた。 該当画分を凍結乾燥した。
    [0033] この凍結乾燥粉末を少量の 0.05M炭酸水素アンモニゥ ム溶液に溶解したのち、 同緩衝液系を用いた Sephadex G -lOO(Pharmacia)カラムを用いて分子篩による分画を行 つ た。 約 4万前後の画分を集めたのち、 凍結乾燥を行つ た。
    [0034] 乾燥粉末を少量の 10mMト リ ス-塩酸（PH7.5)、 0.3M塩 化ナ ト リ ウム溶液で溶解したのち、 同緩衝液系を用いた し oncanavalin A'-Sepharose (Pharmacia) カ ラムを用 ヽて 分画し、 0.2 メチルマン ノ シ ドにて溶出される画分を集 めた。 該当画分を冷却下に Τ充分に透析を行っ たのち凍 結乾燥を行い、 腎生長因子（RGF)粗精製物約 25mgを得た。
    [0035] つづいて、 該耝精製物を等電点による分画精製を行つ た。 し KB等電点鼋気泳動用カラム（ KB Produkter AB, Br omnia, Sweden) ( 11 Οπιβ容量）を用レヽた。 —キャ リ ア一アン ホライ 卜 と して Ampholine pH3.5〜 10 (LKB )、 Ampholin e pH 9 〜 11 (LKB)、 Ampholine pH 7~ 9(LKB)を用レヽた。 5 〜 50%の ソルビトール密度勾配を作成し、 該粗精製物を 2 m£の dense solutionに溶解 したのち力 ラ ム中央咅 βに重 層 した。 電極液と して 1M水酸化ナ ト リ ウム溶液及び 0.0 1M酢酸溶液を用いた。 4 °C 、 800Vの条件下で 24時間の通 電を行っ た。 通電終了後分取用 フ ラ ク シ ョ ン コ レ ク タ 一 を用 いて 1.5m£づっ分取した。 直ちに各画分の PH(4°C ) を測定 した（電気化学工業㈱製 COM- 11、 電極タ イ プ CE 1 05C, 和光純薬工業㈱製 標準緩衝液）。 同時に各画分の 蛋白質の定量を行っ た。 電気泳動の態様は第 1 図に示さ れ'る。
    [0036] その結果、 腎生長因子粗精製物約 1.5mg よ り 、 ρΙ〉10· 32、 pi 10.32-10.15. pi 10.15-9.89, piく 9.89 の各 画分を それぞれおよ そ 104 g'、 281 g、 415 ^ g, 103 μ g 得た。
    [0037] それぞれの画分を冷却下にて充分に透析を行い、 Amph oline 及びソルビ トールを除去 したの.ち、 凍結乾燥を行 つ て粉末化 した。
    [0038] 全く 同一条件で数回の等電点電気泳動法に よ リ 腎成長 因子粗精製物の精製を く り返 し、 各々 の各画分を合一 し た。 尚、 標準蛋白質と して用いたゥマ心臓 ミ オ グロ ビン
    [0039] (Type ffl、 Sigma Chemical CO ·，）の P I値は 7 , 97であつ た。
    [0040] (腎成長促進活性の測定）
    [0041] 上述のいずれの画分が腎成長促進を有する か判定 した。 なお、 レ ノ ト ロ ピンの作用 に よ る腎成長促進効果は、 腎細胞の DNA合成能の促進を指標と した。
    [0042] 平均体重 100g、 同日出生日 の CDラ ッ ト （日本チヤ 一ル ス · 'リバ一株式会社） ォスを下垂体摘出手術及び去勢手 術を施し、 9 日間飼育した。 手術が適切に行なわれたラ ッ トを確認したのち、 対照区も含めて 5 匹以上のラ ッ ト を一群と してそれぞれの実験区を設けた。
    [0043] 等電点電気泳動にょ リ分面したそれぞれの分面 物各 5 0 gを 150 β(5ΌιηΜホウ酸緩衝液 PH7.5、 0.1 % BSA) に 溶蘇し、 ラ ッ トに皮下注射した。 8時間後、 靳頭し、 脱 血したのち直ちに左及ぴ右腎を摘出し、 被膜を剥離した のち
    [0044] corticomedullary axisに f口、つ てスラィ スを各.々 枚 作成した。 2枚のスライ スは 2 mjSの Krebs-Ringer bicar bonate緩衝液（pH7.5) 中にて 37 °C 2時間のィ ンキュベ一 シヨ ンを行っ た。 同緩衝液は、 予じめ 95 %酸'素、 5 %炭 酸ガス混合ガスにて通気を行い、 且つ 1， 2-メチル 3 H -サ イ ミ ジン
    [0045] (New England Nuclear Corps. ) ¾ 2 Ci/mfi 添カロした。 イ ンキュベーショ ン終了後、 4 mMサイジミ ン溶液にてス ライスを リ ンスしたのち一 20 °Cにて保存した。
    [0046] 保存されたスライ スに蒸留水 4 πιβを加え、 ウル トラデ ィ スパーザ（ャマ ト科学》を用いホモゲナイズしたのち、 Fleck A and unro HN(1962, ' Biochim. Biophys. Acta 55、 571) の方法に従って DXA 7
    [0047] の抽出を行レヽ、 Wannemacher JRV and BanksJWL . Wunner WH(1965、 Anal Biochem 11 : 320)の 方法に従っ て DMA の力 [1水分解を行い、 Burton K (1956、 Biochem J . 62 ：
    [0048] 315)の方法に従って牛胸腺 DNA (type I 、 Sigma Chemical Co.)を標準 DMAと して DMA定量を行っ た。 又、 同時に、 抽出 DNA 0.5mJ2中のラジオァクティ ビティ 一を常法に従 い測定した。
    [0049] 腎細胞の DNA合成促進能は、 ラジオアクティ ビティ 一 Z総 DNA量で計算し、 対照区を 100% と と し た実験区の 百分率で算出した。 その結果、 pl〉 10.32画分に 109%、 Pi 10.32〜； 10.15画分に 130% (第 1 図の太い矢印） 、 最 も蛋白質含量が高い PIIO.15〜9.89画分には DI 合成促進 能は無く （98°/。）、 piく 9.89画分に 115% (第 1 図の細い矢 印） の活性があっ た。 従っ て Pi 10.32〜10.15画分及ぴ PI O . 89 ( 9.89〜9.32 ) 画分が腎生長促進成分であっ た t 尚、 pl〉10.32 画分も弱いながらも腎生長促進成分が混 入 しているものと考えられた。
    [0050] 尚、 同 じバッチである腎成長因子粗精製物についても 同時に DN: A合成促進能を測定した結果、 112 %の活性があ- つ た。
    [0051] (腎生長促進成分の in vivoにおける腎成長効果） 平均体重 17g、 同 日 出生 日 の CD-Iマ ウ ス ォ ス（日本 チヤ 一ルス， リバ一株式会社） を下垂体摘出手術及び去 勢手術を施し、 9 日間飼育した。 手術が適切に行なわれ ί 0
    [0052] ていたマウスを確認したのち、 対照区及ぴ実験区それぞ れ 10匹づつの群にわけた。 等電点電気泳動によ リ分画 した 110.32〜10.15面分40 £づっ各々 を150 ^の50111 ホウ酸緩衝液 ΡΗ 7.5； 0.1 % BSA溶液に溶解し、 一匹当 リ 150 /X ΰΖ日づっ 5 日間連繞皮下注射した。 6 日 目 に断 頭 し脱血したのち、 直ちに左及び右腎を摘出し、 被膜 を剥離したのち、 腎を凍結乾燥した。 ラ ッ トの最終体重 当 り の腎乾燥重量を算出し、 对照区と実験区における腎 重量の差を検定した。 その結果、 実験区は対照区に比べ 116%の増加が見られ、 当該画分が腎成長効果を有する ことが判っ た。
    [0053] (腎生長促進成分-のサブュニツ ト α と Ρへの分離と再会 合）
    [0054] 等鼋点電気泳動によ り分画した Pll0.32〜10.15画分を 高速液体ク ロマ トグラ フィーによ りサブュ ニッ ト分離 分取した。 0.1% ト リ フルォ ロ酢酸 （TFA) 水溶液の少 量に溶解したのち、 逆相カ ラム（Baker Bond wide pore butyl C4 ： Baker Rasearch Pro.duct s)を使用し、 0.1% TFA入 り 2-プロノヽ0ノール アセ トニ ト リノレ（ 7 ： 3 )を溶 媒と し 10 %から 50 %の直線勾配にて分離し分取した。
    [0055] サブュニ ッ トの α及び β はそれぞれ主たる 3本づっ のピーク と して得られ、 溶出展に a i ， α 2 ， α 3 , i3 X , β 2 , p 3と名付けた。 試料 3 mg を分離した場合、 収量はそれ ぞれ 230 A g， 450 g， 350 ε , 10 μ g , 570 g, 60 μ g であっ た。 ア ミ ノ酸組成分析等の分析の結果、 a 3， β 3 が共に最も分解の少ない黄体化ホルモ ンである こ と が判 つ た。
    [0056] " 丄と 丄 ， ct 2と j32 ， α 3と jS 3 をそれぞれ等モルづっ 混合し、 少量の 1 %炭酸アンモニゥム水溶液中にて 37°C 48時間保温し両サブユニッ トの再会 合を行っ た。 つづ いて TSK ge& G 3000SWカラム （東洋曹達製）を用いて脱 塩を行っ たのち凍結乾燥を行っ た。 それぞれのサンプル について前述した DNA合成促進能によ り活性の強さ を比 較した。 その結果 α 3 — /53の組合わせが最も強く 、 対 照区と の差に おいて ct i — の組合わせの約 2.5倍の 活性がある こ と が判っ た。
    [0057] 実施例 2
    [0058] 羊脳下垂体粉末 ( W a i t a k i NZ Refrigerating LTD) を 400πιβ冷水に懸濁させたのち、 1 · 5βの 0.15M硫安溶液を 力 []え、 1 Om,Mフ エ ニノレ メ チノレスノレ フ ォ ニノレ フ ゾレオ ラ イ ド 10 mM加えたのち、 冷却しながらポリ ト ロ ン f にて 2分間ホ モゲナイ ズした。 pHを 4.0に調節したのち、 冷却下に充 分放置したのち遠心分離を行い、 上澄液を集めた。 以下 実施例 1 と同様に して処理したのち、 sp-Sephadex力ラ ム 、 bephadex G- 100力 フ ム、 Concanavalm A-Sepharose カ ラ ム にかけ腎生長因子粗精製物を得た。
    [0059] 更に、 実施例 1 と 同様に腎生長因子粗精製物 5 mgを等 電点電気泳動法によ る分画を行っ た。 その結果、 Pl > 9. ί z
    [0060] 85、 ρΙ〉9·85〜9·60、 ρΙ9·60〜9· 10、 ΡΙ9· 10〜8·60、 ΡΙ 8.60〜 7.30、 ρΙ〉 7.30の画分に分けた。 実施例 1 と同様 のバイオアツセィ の結果 Pl> 9.85の画分に腎生長促進成 分が存在するのが確認された。
    [0061] 実施树 3
    [0062] 人脳下垂体油出物 （KabiVitrun AB) 750mJ2を遠心分離 して沈鏢物を集めた。 70mJS 0· 2Mリ ン酸ニ力 リ ゥム水溶 液に懸濁したのち 60 °Cに 3分間加熱し、 つづいて冷却下 に透析を 2 日行っ た。 内容物をと リ出し、 0.13M硫安を 加えたのち PHを 4.0に調節したのち、 0.5Mメ タ リ ン酸溶 液にて PH 3.0に調節し、 冷却下に放置したのち、 遠心分 離を行い、 上澄液を集めた.。 冷却 ¥にて充分に透祈を行 つたのち、 凍結乾燥を行った。
    [0063] 以下実施 ί ΐ と 同様に sp-Sephadexカ ラ ム、 Sephad ex G- 100カラムにかけて耝黄体化ホルモン抽出物を得た 粗黄体ィ匕ホノレモン抽出物を concanavalin A-Sepharose カラムにかけ腎生長因子租精製物を得た。
    [0064] 得られた該耝精製物を等電点電気泳動法による分画を 行った。 得られた各分画につき実施例 1 と同様のバイオ アツセィ を行った結果、 Pl9.12〜 9.90の画分に腎生長促 進成分が存在する のが確認された。
    权利要求:
    Claims
    307
    3
    m 求 の 囲
    黄体化ホルモ ンイ ソ体を有効成分とする腎成長促 進剤
    2 . 腎成長因子粗精製物を等鼋点の差異によって分離 精製処理する こ と を特徴とする腎成長促進活性を有する 黄体化ホルモンィ ソ体の製造法。
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    法律状态:
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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